經(jīng)過細(xì)胞破碎、分段富集、去除部分雜質(zhì)等一系列操作，樣本的體積不斷加大，蛋白質(zhì)濃度下降，有時(shí)已經(jīng)不適合后繼的蛋白質(zhì)樣本檢測(cè)或者上樣了。怎么辦？這個(gè)時(shí)候不外3類選擇：濃縮，沉淀，過柱。過柱既然是分離富集的常用方法，自然也有濃縮特定目標(biāo)蛋白的效果，效果*好的自然是專一吸附富集和洗脫的親和柱，比如HisTag之類的。如果過柱后洗脫濃度還不夠，也要繼續(xù)用其他方法濃縮。親和沉淀或者**沉淀原理也一樣----比如瓊脂糖偶聯(lián)抗體做親和沉淀----借助抗體吸附目標(biāo)蛋白，借助瓊脂糖重力離心沉淀，能有效的富集純化目標(biāo)蛋白，縮小體積，而且不影響目標(biāo)蛋白活性。但是多數(shù)情況下，無處可覓親和的“那一半”，又要繼續(xù)后繼實(shí)驗(yàn)，就只好采用濃縮或者沉淀。
濃縮
由于沉淀可能導(dǎo)致或多或少的樣本損失，不可逆沉淀等問題，原則上，能不用都盡量不用沉淀的方法。冷凍干燥相對(duì)能比較好的保持蛋白質(zhì)活性，非常有效的縮小溶液體積和提高濃度，而且沒有什么損耗和花費(fèi)。問題是你首先得有凍干機(jī)，而且凍干不能去除樣品溶液中的鹽等其他雜質(zhì)。
超濾是濃縮樣品的更好的選擇。超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點(diǎn)是使用不對(duì)稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)，是一種溫和的、非變性的物理分離方法，尤其適用于蛋白質(zhì)等大分子溶液的濃縮，純化以及緩沖體系交換等。超濾操作*簡(jiǎn)單的工具莫過于離心超濾管----通過離心力，使溶液中的小分子溶液和溶劑透過超濾膜,被收集在濾過液收集瓶中，而大分子溶質(zhì)則被超濾膜截流在樣品濃縮管中。該方法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，只需要高速離心機(jī)，無需其他特殊設(shè)備，速度快，可以相當(dāng)?shù)赜行饪s樣本，而且可以部分去除樣本溶液中的鹽、去垢劑等可溶性小分子，有利于更換緩沖體系。
操作：離心超濾管的使用非常簡(jiǎn)單，按照樣品量和目標(biāo)分子量選擇適當(dāng)?shù)碾x心超濾管，加入待濃縮的樣品溶液，按照超濾離心管指示離心速度和時(shí)間離心，*后回收濾管中截留的樣品溶液。
回收率：一般回收濃度大于0.1mg/ml的溶質(zhì)，回收率可達(dá)90%以上。通常樣品損失是由于濾膜表面和容器表面的非特異性吸附引起的。選擇口碑好、高品質(zhì)的離心超濾管非常重要，因?yàn)楦咂焚|(zhì)的離心超濾管選用低吸附材質(zhì)，精細(xì)拋光，可*大限度地降低了吸附性。濾膜表面樣品的吸附量與樣品和濾膜材質(zhì)有關(guān)，一般為2-10μg/cm2。如果研究的對(duì)象是濾過液，由于其濾過時(shí)要穿過濾膜的整個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，所以吸附量相對(duì)較大，為20-100μg/cm2。通常截留分子量高的膜吸附較高，而截留分子量低的膜吸附較低。
為了得到*高的收率，所選濾膜的截留分子量MWCO建議選擇所需截留分子大小的1/3左右，不超過目標(biāo)分子量的一半。因?yàn)槌瑸V膜上孔徑是平均孔徑，膜上的孔并非均勻，離心高壓下也可能滲漏，因此截留孔徑越小，流速越慢但截留比例更大。
如果樣本濃度低體積大，可選擇較小容積的離心超濾管多次重復(fù)加樣離心。如果同時(shí)需要脫鹽和去除可溶小分子雜質(zhì)，可將待濃縮樣品稀釋到離心超濾管*大容積再離心，重復(fù)2次可除去99%鹽。
避免過長(zhǎng)時(shí)間或者過速離心，雖然高品質(zhì)的產(chǎn)品都有防死端設(shè)計(jì)，可避免過度離心造成膜表面干而造成不可逆吸附。避免過度濃縮，*終體積越小，越容易因表面吸附而損失得率。離心后用Tips輕輕吹吸幾次濾膜截留的溶液，必要時(shí)補(bǔ)加一定體積的緩沖液沖洗膜表面，有助于減少膜表面吸附，能提高回收率。盡量避免Tips接觸膜表面。
有些置于2ml離心管的那種Mini離心超濾管可以反向套入離心管中離心（管子上下一樣寬的那種一般都可以），以方便用離心法回收截留蛋白質(zhì)樣品，可使?jié)饪s液達(dá)到近乎完全回收，不用Tips，對(duì)于樣品體積小的就很好。賽多利斯的Vivaspin2ml帶有一個(gè)回收帽，也可以反向離心后可加蓋保存回收樣品，但是那個(gè)管子很長(zhǎng)，要配15ml離心管的離心機(jī)，不過有幾種膜可以選擇。
離心超濾管通常也不能**（個(gè)別種類特別說明除外，如再生纖維素(RC)膜的離心超濾管可以121度**，但是注意那個(gè)pH范圍比較小，別因?yàn)?*就選錯(cuò)），一次性使用。由于單管價(jià)格并不便宜（20-90元），不少人嘗試重復(fù)使用----經(jīng)驗(yàn)是用蒸餾水清洗膜表面多次，離心一次到兩次，那種可以反向離心的小管子可以加蒸餾水浸泡后反向多離心一次，會(huì)好些?？芍貜?fù)用于同一樣品，不用時(shí)可用蒸餾水浸泡，但是要防止**污染。不同樣品就不要混用了。有人說用20%酒精，還有人說用1N的NaOH洗滌，但也有人說會(huì)破壞膜結(jié)構(gòu)。反正廠家一般不支持重復(fù)用。多次重復(fù)使用會(huì)堵塞濾膜上的孔徑，甚至出現(xiàn)漏液現(xiàn)象，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
離心超濾管通常不需要預(yù)處理即可使用（個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，用蒸餾水洗一次會(huì)好些），不過對(duì)于蛋白質(zhì)樣本處理，特別是較稀的蛋白質(zhì)溶液來說(<10ug/mL),用超濾膜濃縮回收率常常是不定量的。雖然PES材料使非特異吸附*小化，但是,某些蛋白,特別是稀的時(shí)候,會(huì)有問題。非特異結(jié)合的程度隨著個(gè)別蛋白結(jié)構(gòu)的不同而不同。含有帶電的或者疏水結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更易于不可逆結(jié)合到不同表面。對(duì)超濾離心管表面做鈍化預(yù)處理可降低蛋白質(zhì)在膜表面的吸附性損失，大多數(shù)情況下，在濃縮稀蛋白溶液之前預(yù)處理柱子可以提高回收率，因?yàn)槿芤嚎商顫M膜和表面暴露的空白蛋白吸附位點(diǎn)。鈍化的方法是預(yù)先用*高容積的鈍化溶液預(yù)浸泡柱子1小時(shí)以上，蒸餾水徹底沖洗柱子，再用蒸餾水離心一次以徹底除去可能殘留在膜上的鈍化溶液。注意鈍化處理后別讓膜干了。如果要留待以后使用，需要加無菌蒸餾水保持膜濕潤(rùn)。常用的鈍化溶液可選擇：
a. 1％牛血清白蛋白磷酸緩沖液溶液
b. 5％十二烷基磺酸鈉蒸餾水水溶液
c. 5％Tween-20非離子活性劑蒸餾水溶液
d. 5％Triton-X 蒸餾水溶液
e. 5％聚乙二醇化合物蒸餾水溶液
f.1％**球蛋白IgG磷酸緩沖液溶液
離心超濾管因?yàn)樾枰咚匐x心，某些對(duì)剪切力或壓力誘導(dǎo)下易變性的不穩(wěn)定樣品可能不太適合。另外超濾膜上孔徑是平均孔徑，膜容易堵，對(duì)于有微小顆?；蛘咚槠臉悠?，*好能先用較大孔徑的離心超濾管過濾一次，再進(jìn)行下一步濃縮。
膜材質(zhì)：選擇超濾膜主要根據(jù)膜的材質(zhì)，截留分子量以及綜合性能等，但是超濾的效果取決于待超濾的樣品溶液的特性，有條件的可以試試不同材質(zhì)的膜。沒有條件就隨大流。聚醚砜PES是超濾離心管中*常見的材質(zhì)，具有較高的化學(xué)和熱穩(wěn)定性，耐堿能力強(qiáng)(pH范圍1--14)，通量大，流速快。其他材料還有三醋酸纖維素(CTA)、再生纖維素(RC)和Hydrosart(HY)。三醋酸纖維素（CelluloseTriacetate，pH范圍3--11）親水性強(qiáng)，非特異性吸附極低，溶劑和小分子溶質(zhì)在過濾時(shí)不會(huì)因被膜吸附而產(chǎn)生損失，適合樣品洗滌、除蛋白以及其他需要回收濾液的操作。再生纖維素（RegeneratedCellulose，pH范圍4--8）也是一種高度親水的膜，對(duì)蛋白的吸附極低，可以高壓**，容易清洗，耐酸堿性能及耐溶劑性能好。當(dāng)用于從低蛋白濃度的稀釋液中回收蛋白時(shí)，可以得到極高的收率。Hydrosart超濾膜（pH范圍3--11）是Sartorius公司的**產(chǎn)品，它的基本特性與再生纖維素類似，Hydrosart在具有極低的蛋白吸附性的同時(shí)，又具有高流速和高通量的特性，是**球蛋白濃縮和脫鹽的理想用膜。
規(guī)格：市面上常見的規(guī)格，截留量來說從3K, 5K, 10K,30K, 50K,100K的都有，從*大容積來說，離心管500ul到20ml的都有，單個(gè)價(jià)格從20-90。建議所選濾膜的截留分子量MWCO建議選擇所需截留分子大小的1/3左右。
品牌的選擇：離心超濾管知名廠家有Sartorius,Millipore,Pall和Whatman等等。都是經(jīng)典的品牌。其中Sartorius的Vivascience超濾離心管采用**的垂直膜配合狹長(zhǎng)的流道（垂直切向流）設(shè)計(jì)，有效地避免了濾膜阻塞，即使對(duì)于含有顆粒的溶液，也能達(dá)到高速超濾。PE公司也購買Vivascience公司的**，PE的蛋白質(zhì)樣本富集試劑盒也是Vivascience設(shè)計(jì)的。
另外值得推薦的是Vivapore溶劑吸附濃縮器，不需要任何附加設(shè)備，只需把待濃縮的樣品加入Vivapore濃縮器中，靜置，等達(dá)到需要的濃縮倍數(shù)后，用吸管回收即可，只是速度會(huì)比較慢。溶劑吸附法用于常規(guī)目的實(shí)驗(yàn)室濃縮或進(jìn)一步分析前的樣品純化，尤其適用于在剪切力或壓力誘導(dǎo)下易變性的不穩(wěn)定樣品溶液，以及需要在低溫環(huán)境下操作的溶液。處理量：0.5ml - 20 ml，截留分子量：7.5K/30K。待續(xù)
